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临床质谱提纯的前处理——分离提纯

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临床质谱提纯的前处理——分离提纯

质谱样品

样品前处理是质谱分析的关键步骤,其中包括样品的提纯、分离和富集等。

临床上血液等生物样本却不能直接送入质谱进行分析,而必须要经过一系列的样品前处理流程(如蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等),以达到净化或纯化样品,降低基质干扰,提升灵敏度和准确性的目的。

固相萃取

固相萃取(Solid-Phase Extraction,SPE)主要用于样品的分离、纯化和浓缩,能有效的将分析物与干扰组分分离,减少样品预处理过程,操作简单、省时、省力。固相萃取理论上非极性、极性、离子型目标物都可以适用,这也是近年来固相萃取技术越来越流行的原因。由于临床上样本量大,报告周期短,为了更好的提高通量和效率,很多实验室会把96孔萃取板作为固相萃取的首选。SPE固相萃取按照保留物质分为类:一类为保留目标化合物,另一类为保留杂质;按照填料类型分为三类:非极性保留型,极性保留型,离子交换型。以保留目标物的固相萃取为例,基本操作步骤为活化、上样、淋洗、洗脱四个环节。

液液萃取

液液萃取是一种利用不同相溶性进行分离的方法。在该方法中,待分析的样品与有机溶剂混合,利用溶剂之间的相互作用力和分配系数,将目标分子从水相中分离出来。然后再将有机溶剂分离,分离后的有机溶剂中就含有目标分子。

蛋白沉淀

蛋白沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。蛋白质从溶液中析出的现象,称为蛋白质的沉淀。

a.有机溶剂沉淀法是最常用方法,一般沉淀试剂以甲醇、乙醇、乙腈为主,适用目标物为生物小分子、糖类。

b.盐析法,当目标物为非蛋白质时,纯盐析法在临床质谱领域应用较少,因为沉淀后会引入高浓度盐,长时间进样的话会对仪器灵敏度和柱压产生影响。所以,一般使用盐析法沉淀后,样本还需经过稀释、减少进样量或者透析除盐等步骤。盐析法沉淀出的蛋白并没有失活,所以主要用于蛋白质和酶的提取。

c.加热凝固法,将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热,可使蛋白质发生凝固而沉淀。此方法主要选择性去除不耐热的杂蛋白。适用于具有较强的热稳定性的物质,例如葡萄糖。

蛋白沉淀传统操作方法为使用离心管与离心机搭配,但是此种方法需要单一处理样本,会出现效率低、人为误差等问题。所以,此方法更加适用于前期的方法开发与科研项目,不适用于样本量大的实验室的检测。

为解决样本量大的问题,进行大批量样本的前处理,效率可提高数倍。96孔蛋白沉淀板搭配自动化设备,操作简便,可将分离的过程缩短,可减少人为误差和提高效率。

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