西南交通大学作者Yuzhu Li在European Journal of Medicinal Chemistry上发表的“Design, synthesis, and biological evaluation of low-toxic lappaconitine derivatives as potential analgesics”一文中，使用离子通道阅读器（ICR）研究了LA先导化合物对钠通道和hERG通道的影响，进一步揭示了其镇痛和毒性减毒机制。钠通道实验表明，这些先导化合物的镇痛机制是抑制Nav 1.7通道。化合物39作为一种新的镇痛先导化合物，毒性显著低，活性与LA相当。
背景
Lappaconitine（LA）是从乌头中分离出来的二萜生物碱。LA（ED50 = 3.5 mg/kg）的镇痛作用是氨基匹林的7倍，相当于吗啡和哌替啶，是一种在中国使用的非成瘾性镇痛药。然而，LA治疗窗口期狭窄，限制了LA作为一种更有效的镇痛药的广泛使用。因此，修饰Lappaconitine以找到更安全的衍生物，结合更好的镇痛活性和更低的毒性是相当重要的。
电压门控钠通道（Navs）作为一种重要的跨膜蛋白，在神经细胞、肌肉和心脏组织等可兴奋细胞中动作电位的产生和传递中起着至关重要的作用。据报道，LA具有镇痛活性，因为它是一种Nav 1.7抑制剂。
图源：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S022352342200678X?via%3Dihub
实验方法
钠通道测试方法
使用 HEK-Nav1.7细胞系，细胞培养板在细胞铺板前包被0.1 mg/L的聚d-赖氨酸（PDL），用ddH2O洗涤两次。将处于对数生长期的细胞以8×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中。贴壁生长24 h后，取出细胞培养基，加入200 μL无钠缓冲液，37◦C，5%二氧化碳孵育15 min。孵育后，弃置无钠缓冲液，用溶解在无LiCl缓冲液中的化合物处理细胞8 min。然后将细胞与含有藜芦醇（30 μM）和乌头碱（50 μM）的LiCl缓冲液中孵育90 min。孵育后，用无LiCl缓冲液洗涤细胞，去除细胞外LiCl。然后，加入1%的Triton X-100裂解细胞，用ICR8000在670.8 nm处测定Li+在细胞裂解液中的浓度。
hERG通道测试方法
使用HEK-hERG细胞系，细胞培养板在细胞铺板前包被0.1 mg/L的聚d-赖氨酸（PDL），用ddH2O洗涤两次。将处于对数生长期的细胞以8×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中。贴壁生长24 h后，取出细胞培养基，用200 μL上载缓冲液洗涤细胞，加入200 μL上载缓冲液，37◦C，5%二氧化碳孵育3h。孵育后，弃上层缓冲液，用缓冲液洗涤3次。向细胞加入200 μL药物开放缓冲液，反应4 min，然后移液管200 μL上清液（细胞外液）进入新的96孔板，每孔加入200 μL裂解缓冲液，吹打混匀使细胞裂解完成，这部分液体是细胞内的。使用ICR8000测量Rb+在细胞内液和细胞外液中的浓度，Rb+流出比=细胞外液离子浓度/（细胞外液离子浓度+细胞内液离子浓度）×100%。
实验结果
钠通道分析
图源：参考文献
如上图表所示，所有的先导化合物在100μM时对Nav 1.7通道都表现出抑制作用。酰胺系列化合物35和39在10μM时可抑制通道，表明先导化合物的机制与LA相同，均通过抑制Nav 1.7通道发挥镇痛作用。
hERG通道分析
图源：参考文献
如上图表所示，化合物35、36、49、70和89可以以浓度依赖的方式降低Rb +外排比，说明这些LA衍生物会抑制hERG通道。化合物49，其钾通道抑制作用已证明它可能存在心律失常的潜在风险。化合物39即使在最高的试验浓度下也没有对钾通道有任何明显的抑制作用。基于以上结果，酰胺系列化合物中的39是最潜在的LA衍生物，在保持镇痛活性的同时，显著降低了LA的毒性，而没有心律失常的风险。
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